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ELISA实验操作视频

Experimentaloperationvideo

ELISA因其敏感性高、特异性强等特点，被广泛用于临床或科研中抗原和抗体的检测。ELISA实验操作相对简单，但小实验蕴含大道理，细节稍不注意很容易产生假阳性或假阴性。接下来，博士德将以预实验的方式为大家演示ELISA具体实验操作过程。

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ELISA实验注意事项

mattersneedingattention

1.实验前

1)确认移液器是否校准

2)确认各个仪器设备是否正常运行

3)检查试剂盒各个组分和规格是否与说明书一致

2.预实验

1)建议标准曲线和样本一起做

2)样本可在不同组别中挑选具有代表性的样本

3)预估样本含量，可采用1:1/1:10/1:等稀释比做预实验，确定样本稀释比例

3.标准品溶解

1)推荐使用漩涡器

2)反复颠倒混匀

3)溶解后的标准品按说明书进行保存

4.加样

1)推荐使用排枪

2)提高加样速度，避免板子干燥时间太长

3)避免出现太多气泡

5.孵育

1)严格按照说明温度和时间进行孵育

2)避免板子叠加孵育

3)每次都需要使用新的封板膜进行孵育，避免交叉污染

6.洗板

1)推荐使用自动洗板机洗板

2)人工洗板时，每次板孔尽量拍干

3)每孔至少保证ul洗液量

7.数据统计

1)建议采用四参数曲线对数据进行拟合

2)曲线R值一般不低于两个9

3)可使用拟合软件

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ELISA标本处理方法

Sampleprocessingmethod

可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液）、细胞培养上清、细胞、组织等均可作标本以测定其中某种成份。有些标本可直接进行测定，有些则需经预处理。

1.血清

室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（-0转/分）。收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

2.血浆

应根据试剂盒的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，加入10％（v/v）抗凝剂(0.1M柠檬酸钠或1%heparin或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分钟后，离心20分钟左右（-0转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

3.尿液、胸腹水、脑脊液

用无菌管收集。离心20分钟左右（-0转/分）。仔细收集上清。如有沉淀形成，应再次离心。

4.细胞培养上清

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（-0转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（-0转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.细胞

检测细胞的成份时，对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞10秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍.加入适量裂解液,用枪吹打把细胞吹散。用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装然后再裂解。充分裂解后，00-g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续操作。

6.组织标本

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS或组织蛋白萃取试剂，缓冲液中可加入蛋白酶抑制剂。用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（-0转/分）。仔细收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以将样品浓缩干燥。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

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ELISA实验常见问题

FrequentlyAskedQuestions

1.信号弱

2.背景高

3.无信号

4.梯度稀释时出现跳孔现象

5.标曲佳但样本孔无信号或信号偏高

6.边缘效应

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博士德ELISA产品优势

Productadvantages

1.灵敏度

ELISA试剂盒可检测低浓度的蛋白，检测能力可达到pg/mL，保证蛋白检测的准确性。

24个健康人的血清样本进行ELISA检测，利用HumanIL-1betaELISAKit（EK)检测24个正常人血清样本。

2.特异性

只检测目标分析物，每个试剂盒都经过广泛的相关分子的交叉反应测试，确保无交叉反应和干扰。

选择和HUMANFOLR2相关的蛋白，进行特异性分析，用远高于检测限的蛋白浓度进行测试分析。

3.稳定性

不同批次的ELISA试剂盒在标准曲线上进行了重复性试验保证批间CV值小于10%。

三个不同浓度MouseTNFα的样本（不同颜色线），用4个不同批次持续12个月检测。

4.回收率

通过回收实验测试确认试剂盒是否受干扰因子的影响。

将高、中、低3个不同浓度的分析物加入到对应的样本(血清、血浆、细胞上清)中检测，并计算蛋白的回收率，回收率标准一般是80%-%。

5.蛋白定量

ELISA试剂盒中的标准品并不是简单的质量定量，不同厂家使用的标定方法也各种差异。博士德参考了WHO国际标准，并进行了校正。