目的：制定多肽切割标准操作规程。

范围：适用于多肽切割操作过程。

职责：多肽组切割操作人员及QA对本规程实施负责。

规程：

1

切割准备工作

切割前，要称重干燥后的肽树脂，TFA提前一天放冰箱预冻，乙醚预冻3小时以上。苯酚放入水浴锅55度加热溶解。准备好干净的5L塑料杯2-3个，干净的1L,ML,ML量筒各一个。干净的玻璃砂芯漏斗一个，5L,10L抽滤瓶各一个，布氏漏斗一个，滤纸一张，60L塑料桶一个。

2

配切割液

根据多肽序列和侧链情况选择切割配方。肽链不含Arg,Met,Trp,Cys氨基酸及trt保护基的短肽，使用A配方；肽链含Arg,Met,Trp,Cys的用B配方，肽链有Trp及trt保护基的短肽用C配方。

A配方：90%TFA5%Tis5%H2O

B配方：87%TFA4%EDT3.5%茴香硫醚3.5%苯酚2%H2O

C配方：88%TFA3.5%Mpa3.5%TIS3%苯酚2%H2O

长肽中含有Trp时，看Trp左右的氨基酸是否是疏水氨基酸，如果是，则配方中H2O比例适当提高。切割温度要降低到25度左右，时间3.5-4h.

3

开始切割

切割液体积按照粗肽树脂重量的5-9倍，装入5L塑料杯，恒温水浴锅磁力搅拌，树脂慢慢加入。加入后看溶液的浓度，太浓需要补加切割液。

切割液倍数选择：超短肽（含4AA以内）：4-5倍，短肽（5-10AA）：5-6倍，中等长度（10-20AA）：6-7.5倍，稍长（20-30AA）：7.5-9倍，长肽（30AA以上）：8-10倍。

裂解反应一般3小时，有Trp时，序列判断需要降温的，时间可以延长至3.5-4小时。反应结束后，用砂芯漏斗抽滤，滤出的树脂再用适量的TFA搅拌几分钟，再抽滤，合并滤液。

4

沉淀

在塑料桶中倒入5-6倍切割液体积的冰乙醚，把抽滤出来的切割液边搅拌边缓慢倒入冰乙醚中，搅拌均匀，防止局部放热温度过高。倒完后静置10min。取上层的清液20ML,再加入10ML乙醚，看是否有东西析出，如有明显析出，则向大桶中补加乙醚。

5

抽滤洗涤

在布氏漏斗中先垫一层滤纸，用水湿润，开泵抽使滤纸吸附在漏斗平面上，再放入滤袋抽滤，抽滤时经常搅拌样品，防止底部沉积过密导致不畅。抽滤结束后，用常温乙醚再洗3遍，每次洗涤要把样品充分搅散。

6

干燥

三遍洗完后，先在布氏漏斗上尽量把乙醚抽干一点（空气潮湿时，为防止吸潮可以缩短时间），再把半湿半干状态的样转入真空干燥器中干燥。最后称重，记录，送纯化。

注意事项

1.配制切割液或者取用切割液时动作必须缓慢，防止切割液飞溅

2.机械搅拌速度不宜过快，防止树脂飞溅到液面以上，不参与反应

3.过滤树脂时应用TFA洗涤反应器多次，直至反应器内无树脂残留，洗出的液体无色透明

4.乙醚提前放入冰箱冷藏30分钟

5.烘干多肽时注意多肽状态，若发现多肽吸潮，需重新用乙醚洗涤，重新烘干

6.注意保存实验记录，实验现象，多肽粗品的颜色及重量

杭州固拓生物科技有限公司是一家专业从事多肽以及相关衍生物研发和生产的国家高新技术企业。公司主要从事多肽原料药中间体，化妆品多肽、定制多肽等的研发和生产，以及相关的HPLC纯化服务、生物检测服务；同时也致力于保护氨基酸、蛋白、小分子化学、荧光染料、糖类衍生物、核酸，抗体、医药中间体等产品的开发等全方位服务。

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